Przygotowanie krzywej wzorcowej do badań spektrofotometrycznych

Metoda krzywej wzorcowej

Jest jedną z podstawowych metod analitycznych służącą do ilościowego oznaczania substancji. Polega na graficznym przedstawieniu zależności między zmierzonym sygnałem analitycznym (np. absorbancją) a stężeniem/zawartością substancji w roztworze.

Poniżej przedstawiono instrukcję sporządzania krzywej wzorcowej na przykładzie ćwiczenia dotyczącego oznaczania żelaza w wodzie metodą kolorymetryczną z podziałem na etapy oraz wyjaśnieniem ich celu i sposobu wykonania.

1. Przygotowanie roztworów wzorcowych (skala wzorców)

Co: Przygotowanie serii roztworów o znanym stężeniu/zawartości żelaza.

Jak: Precyzyjnie rozcieńczamy wodą destylowaną roztwór wyjściowy żelaza (o stężeniu 0,05 mg Fe/cm³) przy użyciu pipety jednomiarowej i kolb miarowych o pojemności 100 cm³. Zaleca się przygotowanie sześciu różnych stężeń, które obejmują spodziewany zakres stężenia w badanej próbce. Dla sporządzenia krzywej wzorcowej dobiera się możliwie dużą ilość wzorców w celu zwiększenia dokładności pomiaru.

Do każdej z sześciu kolb należy dodać ilość roztworu żelaza zgodną z wartościami przedstawionymi w tabeli 1 oraz 0,5 cm³ 3% roztworu wody utlenionej H₂O₂ w celu utlenienia żelaza do trójwartościowego. Po upływie 5 minut należy dodać 5 cm³ 5% roztworu rodanku amonu NH₄NCS, a następnie uzupełnić wodą destylowaną do 100 cm³.

Otrzymujemy roztwory wzorcowe jak na fot. 1.

Dlaczego: Musimy stworzyć układ odniesienia. Im dokładniej przygotujemy wzorce, tym mniejszy będzie błąd w późniejszym odczytywaniu nieznanego stężenia/zawartości analitu.

lp.	ilość roztworu wyjściowego Fe do przygotowania wzorca [cm³]	zawartość Fe w roztworze wyjściowym [mg] (0,05 mg Fe/cm³)
1	0	0,0
2	2	0,1
3	4	0,2
4	6	0,3
5	8	0,4
6	10	0,5

Tabela 1. Przygotowanie roztworów wzorcowych

Sześć kolb miarowych z roztworami wzorcowymi o rosnącej intensywności barwy — Fot. 1. Roztwory wzorcowe

2. Dobór parametrów pomiarowych (λmax)

Co: Ustawienie analitycznej długości fali.

Jak: Ustawiamy długość fali w spektrofotometrze w punkcie, w którym występuje maksimum absorpcji (λmax) – w analizowanym przypadku jest to λmax = 466 nm.

Dlaczego: Pomiary wykonuje się przy λmax, ponieważ zapewnia to najwyższą czułość oznaczenia – nawet małe zmiany stężenia wywołają wtedy wyraźną zmianę sygnału.

λ_{ma x} = 466 nm

3. Pomiar sygnału (kalibracja urządzenia i wzorców)

Co: Wykonanie pomiaru absorbancji dla „próby ślepej” (zerowa zawartość żelaza) oraz serii pozostałych wzorców.

Jak: Zerujemy aparat na tzw. próbie ślepej (rozpuszczalnik bez analitu). Następnie mierzymy absorbancję wzorców (fot. 2), zaczynając od najniższego do najwyższego stężenia.

Dlaczego: Zerowanie eliminuje sygnał tła pochodzący od rozpuszczalnika lub samej kuwety. Kolejność od najniższego stężenia minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia próbek kolejnymi, bardziej stężonymi roztworami.

Wyświetlacz spektrofotometru Spectroquant Pharo 300 z odczytem absorbancji 0,438 — Fot. 2. Pomiar absorbancji

4. Wykreślenie krzywej wzorcowej i wyznaczenie równania prostej

Co: Stworzenie wykresu zależności zawartości żelaza od absorbancji.

Jak: Na osi X nanosimy zawartość żelaza w roztworach wzorcowych, na osi Y zmierzony sygnał (absorbancję) (rys. 1). Korzystając z regresji liniowej (np. w Excelu), wyznaczamy równanie prostej:

y = a x + b .

Zawartość żelaza [mg]	Absorbancja
0,0	0,0
0,1	0,163
0,2	0,321
0,3	0,481
0,4	0,645
0,5	0,817

Dane do wykreślenia krzywej wzorcowej

Wykres liniowy zależności absorbancji od zawartości żelaza z równaniem y = 1,626x − 0,002 i R² = 0,9998 — Rys. 1. Przykładowa krzywa wzorcowa

5. Oznaczenie badanej próbki

Dlaczego: Zgodnie z prawem Lamberta-Beera, absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia. Wykres pozwoli później za pomocą znanej absorbancji odczytać konkretną wartość zawartości żelaza w badanej próbce.

Co: Oznaczenie zawartości żelaza w badanej próbce.

Jak: Mierzymy absorbancję próbki. Znając absorbancję, oznaczenie zawartości żelaza polega na:

a) podstawieniu wielkości absorbancji (y) do przekształconego równania prostej regresji:

x = \frac{y - b}{a}

Roztwory wzorcowe ustawione obok próbki o nieznanej zawartości żelaza — Fot. 3. Roztwory wzorcowe i próbka o nieznanej zawartości żelaza

Krzywa wzorcowa z zaznaczonym odczytem zawartości żelaza dla absorbancji 0,420 — Rys. 2a. Odczyt zawartości żelaza w badanej próbce przy wykorzystaniu przygotowanej krzywej wzorcowej

Odczyt z papieru milimetrowego

W analizowanym przykładzie:

Oś X: 2 cm = 0,1 mg Fe = 20 mm = 0,1 mg

Oś Y: 1 cm = 0,1 jednostki absorbancji = 10 mm = 0,1 A.

Odczyt na osi X: 20 mm = 0,1 mg, czyli 1 mm = 0,005 mg Fe.

Na osi Y znajdujemy wartość absorbancji = 0,420. Prowadzimy linię poziomą (równoległą do osi X) aż do miejsca, gdzie przecina prostą (zaznaczona na rysunku poziomą czerwoną przerywaną linią). Na wykresie jest to czerwony punkt.

Z tego punktu przecięcia prowadzimy linię pionową w dół (równoległą do osi Y) aż do osi X (zaznaczona na rysunku pionową czerwoną przerywaną linią).

Miejsce przecięcia tej pionowej linii z osią X odpowiada zawartości żelaza w próbce. Na przedstawionym wykresie punkt wypada około 52 mm od początku układu współrzędnych.

Zatem:

x = 52, 2 mm \cdot 0, 005 \frac{mg}{mm} = 0, 261 mg Fe

Absorbancja	Zawartość żelaza [mg]
0,0	0,0
0,16	0,1
0,32	0,2
0,42	0,267
0,48	0,3
0,65	0,4
0,82	0,5

Odczyt ze skali (papier milimetrowy)

Krzywa wzorcowa na papierze milimetrowym z czerwonymi liniami odczytu; skala 2 cm = 0,1 mg Fe na osi X i 1 cm = 0,1 jednostki absorbancji na osi Y — Rys. 2b. Odczyt zawartości żelaza w badanej próbce przy wykorzystaniu przygotowanej krzywej wzorcowej (skala: 2 cm = 0,1 mg Fe na osi X, 1 cm = 0,1 jedn. absorbancji na osi Y)

Źródła

Buniak W., Jagiełło E. Chemia ogólna. Działy wybrane i ćwiczenia. Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, Wrocław 2009, Wydanie II (s. 528)

https://goldbook.iupac.org/terms/

https://galaxy.agh.edu.pl/~graboska/dydaktyka/Nowoczesne-techniki-badawcze-w-inzynierii-materialowej---cwiczenia-laboratoryjne/

http://mazur.zut.edu.pl/Cwiczenia%20Lab/materialy%20pomocnicze/Chemia/spektrofotometria.pdf

Wykresy przygotowane z wykorzystaniem asystenta AI (Claude, Anthropic)

Opracowanie przygotowane w ramach projektu „System zarządzania drop-out na UPWr: monitorowanie i zapobieganie” przez zespół w składzie: dr Joanna Kajewska-Szkudlarek, dr inż. Sylwia Charazińska, dr hab. inż. Paweł Lochyński, prof. UPWr. Wersja dokumentu: 1.0.

Kluczowe wzory i definicje

spektrofotometria

polega na pomiarze stosunku natężeń (lub jego funkcji, np. absorbancji) dwóch wiązek promieniowania w funkcji długości fali, z których jedna jest wiązką promieniowania oddziałującego z badaną próbką, a druga wiązką odniesienia

absorbancja

logarytm dziesiętny stosunku natężenia wiązki promieniowania padającego na badaną próbkę do natężenia wiązki promieniowania przechodzącego przez badaną próbkę

absorpcja promieniowania

zjawisko polegające na pochłanianiu przez materię przechodzącego przez nią promieniowania (osłabienie natężenia promieniowania)

kolorymetria

metoda analityczna polegająca na otrzymaniu barwnego związku oznaczanego pierwiastka przez dodanie odpowiedniego odczynnika, a następnie pomiarze intensywności powstałego zabarwienia, która jest zależna do stężenia oznaczanego pierwiastka

prawo Lamberta-Beera

absorbancja równoległej wiązki promieniowania monochromatycznego w jednorodnym, izotropowym ośrodku jest wprost proporcjonalna do długości drogi optycznej (drogi absorpcji) oraz stężenia substancji absorbującej

Ćwiczenia

Wkrótce

Ćwiczenia do tego tematu pojawią się razem z właściwą treścią.